血脑屏障

大脑作为人体的“机密重地”，掌控着人体的多项重要功能。而血脑屏障能够把血液中可能存在的毒素、病原体等有害物质拒之门外，保护脑组织的安全。

通俗来讲，血脑屏障（BBB）就是大脑的“大门”。血脑屏障对保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。

但是，中枢血脑屏障的存在，一方面保护大脑免受外界物质的入侵，另一方面也阻碍了病毒载体的靶向递送，成为了阻碍中枢神经系统（CNS）疾病治疗的一道天堑。

AAV.CPP.16是什么？

2022年10月10日，美国哈佛大学布列根和妇女医院神经外科系 Fengfeng Bei 团队在 Nature Biomedical Engineering 期刊在线发表题为：Variants of the adeno-associated virus serotype 9 with enhanced penetration of the blood-brain barrier in rodents and primates 的研究论文。

该研究报告了一种新型腺相关病毒（AAV）变体——AAV.CPP.16，在临床前动物试验中表现出比以前开发的运载工具更高效的递送效率，能够突破血脑屏障的限制，可用于治疗脑肿瘤（如胶质母细胞瘤）和中枢神经系统遗传疾病。

在过去二十年里，人类在基因治疗领域取得了一系列里程碑突破。基因治疗也逐渐成为当前最火热的新兴疗法之一，特别是腺相关病毒（AAV）已成为基因治疗的首选递送载体，也被公认为最有前景的递送载体。

在过往的研究中，科学家们已经发现了腺相关病毒（AAV）可以在某些情况下穿越血脑屏障，但通常情况下，AAV的这种穿越血脑屏障的递送效率较低，无法满足针对脑部的基因疗法的治疗需求。因此，Fengfeng Bei 团队致力于优化AAV，提高其越过血脑屏障的效率和传递药物的潜力。

在这项最新研究中，为了改进现有的AAV，研究团队将目标锁定在细胞穿膜肽（CPP）——一组已知能够穿过生物膜（如血脑屏障）的短肽。研究小组收集了大约100种细胞穿膜肽，并将它们插入到各种AAV中，然后对这些重组AVV逐个进行测试，以寻找最有效的。经过一系列的测试和不断优化，研究团队十分幸运地找到了答案——AAV.CPP.16。

AAV.CPP.16的高效性

转导效率提高6倍

作为正在进行的筛选工作的一部分，研究人员在AAV9衣壳中常用的588/589位点基因插入了14个单独的细胞穿透肽（CPP），并筛选了这些AVV变异体穿透BBB的能力。进一步测试了另外七种CPP样肽，以优化第一轮筛选中的最佳CPP候选肽。分别产生AAV候选病毒，并将其静脉注射到小鼠和非人类灵长类动物（特别是食蟹猴）体内，以评估其对中枢神经系统的转导。

该课题组鉴定了两种肽插入物（AAV.CPP.16中的TVSALK和AAV.CPP.21中的TWSALFK），它们在多个小鼠品系中可以将AAV9衣壳的转导效率提高了6倍以上。重要的是，AAV.CPP.16的神经趋向性从小鼠转移到食蟹猴身上。AAV.CPP.16比AAV9在动物模型中的这种增强作用与作者的发现是一致的，即AAV.CPP.16与AAV9相比，在人类BBB的体外模型中显示出更多的穿胞作用，并在培养的人类细胞系中增强转导。

AAV.CPP.16的有效性

紧接着，研究团队进一步检测了AAV.CPP.16的有效性，他们发现，AAV.CPP.16表现出较高的脑部神经元细胞、星形胶质细胞和脊髓神经元的感染亲和力。在安全性方面，虽然静脉注射AAV.CPP.16仍可感染外周脏器，如肝、肌肉、心脏和背根神经节等，但并未引起显著持续性肝脏毒性反应以及背根神经节退化变性。

AAV.CPP.16的优越性

那么，是什么原因导致AAV.CPP.16具有较高的跨越血脑屏障的递送效率呢？研究人员发现，AAV.CPP.16并非通过破坏性方式，而是显著提高上皮细胞的转胞吞作用，从而跨越血脑屏障。

AAV.CPP.16的潜力

研究人员还发现AAV.CPP.16可用于在胶质母细胞瘤的小鼠模型中静脉递送抗程序性死亡配体1抗体（αPD-L1）或单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（一种 "自杀 "基因，与前体药物结合后可杀死肿瘤细胞）。尽管AAV.CPP.16只转导了一小部分肿瘤细胞（大约10%），但这两种治疗方法都产生了惊人的促进生存的益处。

AAV.CPP.16是向中枢神经系统递送治疗性转基因的很有希望的载体，特别是对于具有弥漫性病理和明确遗传病因的疾病。要考虑的疾病目标包括中枢神经系统疾病，在这些疾病中，可以应用细胞之间的“交叉纠正”，例如通过分泌蛋白质。

鉴于AAV.CPP.16对运动神经元或浦肯野细胞的高度趋向性，主要影响运动神经元或浦肯野细胞的中枢神经系统疾病也可以成为靶点，而且使用AAV.CPP.16通过BBB传递抗体来治疗胶质母细胞瘤是可能的。事实上，在胶质母细胞瘤中，血脑屏障只被部分破坏，而对于这种癌症，血脑屏障药物输送有限是其他有希望的治疗失败的主要原因。

为了检测AAV.CPP.16的临床运用潜力，研究人员还探究了AAV.CPP.16作为基因治疗载体治疗恶性胶质瘤的潜力。使用AAV.CPP.16递送PD-L1的研究表明，相比于AAV9，AAV.CPP.16在恶性胶质瘤微环境中的递送效果提升约17.5倍，显著增加CD8+T浸润和IFNg分泌，减少了Treg细胞浸润，从而有效提升荷瘤小鼠生存率至75%，长期存活小鼠复发瘤模型存活率达到100%。

此外，AAV.CPP.16递送的HSV-TK1疗法结合腹腔注射GCV可以明显杀伤肿瘤细胞，减少肿瘤体积，并提高荷瘤小鼠生存率约至57%。

研究局限性

研究人员没有系统地评估AAV.CPP.16在非人类灵长类动物中的转导水平。研究人员使用的报告基因和或免疫组织学方法在允许转导细胞的可视化方面是不理想的。由于技术原因，也没有在非人类灵长类动物中进行病毒基因组的生物分布。

该研究的另一个注意事项是，当AAV.CPP.16在标准的实验室环境中制备时，会在高浓度下观察到病毒颗粒的聚集。尽管现在有证据表明，这种聚集是由AAV.CPP.16制剂中的杂质引起的，但目前还不清楚这种问题是否以及如何影响本研究中AAV.CPP.16的转导效率。