来源:创始人 更新时间：2022-11-01
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已成为一种有前途的癌症治疗工具，彻底改变了癌症免疫疗法。尽管缓解率很高，但并非每个患者在CAR-T细胞治疗后都能达到完全缓解（CR），大量患者会经历复发。
这推动了对克服CAR-T细胞耐药性和复发机制的深入研究，目前已经取得了显著的技术进步，如纳米抗体和CRISPR-Case9，以确保CAR-T细胞疗法充分发挥其医疗潜力。
Eshhar等人首先设计了CAR-T细胞技术来表达抗原受体。到目前为止，CAR结构(CARs)已经经过了五代发展。
CAR-T治疗的机制一种单抗通常用于产生CARS的胞外部分。识别TAA的单链抗体由VL区和VH区组成。除了ScFv，靶向域还使用VHH，也被称为纳米抗体，它是从HcAbs的可变域衍生的。
铰链区连接跨膜区和胞外区。细胞内激活区可分为共刺激区和信号区。共刺激机制产生的信号依赖于共刺激结构域(CD28依赖于PI3K，而4-1BB使用NF-κB和TRAF)。
CD3-ζ通常是一个含有三个ITAM的信号区。一旦单链抗体识别并结合TAA，ITAM的磷酸化就通过ZAP70启动信号转导，然后发出信号释放T细胞反应(颗粒酶和穿孔素/BID或FADD)。
CAR-T细胞主要依赖于工程化CARS，表现出抗原特异性和T细胞杀伤作用。当CAR-T细胞识别特定的TAA（肿瘤相关抗原）时，ITAM(免疫受体酪氨酸激活基序)通过磷酸化作用启动，促进增殖，释放细胞因子并增强免疫反应。
但这种约束机制有一定的局限性。TAAs(如CD19或CD20)的表达缺失是肿瘤耐药性产生的关键机制之一。此外，与肿瘤特异性抗原(TSA)不同，TAA选择性较低，在肿瘤上过度表达，但在正常器官和组织上也表达，导致脱靶效应并引起安全问题。
细胞毒性通常通过两大途径发挥作用：
1.CAR-T细胞分泌颗粒酶和穿孔素是抑制肿瘤进展（主要途径）。
2.通过激活凋亡信号通路刺激癌细胞的凋亡，包括激活BH3相互作用结构域死亡激动剂(BID)和FAS相关死亡结构域蛋白(FADD)。
这一部分总结了用于治疗血液系统恶性肿瘤的前沿商业CAR-T药品的最新研究进展。
1.Kymriah (Tisagenlecleucel)
Kymriah是FDA在2017年批准的第一个CAR-T细胞产品(CD19/FMC63)，用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞白血病(B-ALL)难治性或二次或以后复发的患者(25岁以下)。次年，Kymriah获批用于治疗成人复发/难治性大B细胞淋巴瘤(R/R LBCL)。
在Juliet(NCT02445248)II期试验中，111例R/R LBCL患者接受输液。ORR(客观缓解率，肿瘤缩小的保持时间的病人比例)为52%，CR率为40%。最常见的CRS和ICAN是最常见的不良反应，发生率分别为56%(22%≥3级)和21%(12%≥3级)。与其他药物比较，Kymriah3级以上CRS的发生率相对较高。
2022年5月27日，Kymriah被FDA批准用于治疗经过二线或二线以上系统治疗的成人R/R FL患者的新适应症。这一批准是基于全球2期Elara试(NCT03568461)，标志着Kymriah拥有了第三个适应症，扩大了治疗的疾病范围。
但在白细胞分离过程中，与淋巴细胞聚集在一起的循环肿瘤细胞可能无意中被CARS转导，这可能通过肿瘤细胞表达的CARS与同一细胞上的TAA结合而导致抗原掩蔽，导致体内克隆性增殖和肿瘤细胞逃逸。
2.Yescarta (Axicabtagene Ciloleucel)
Yescarta(Axicabagene Ciloleucel，KTE-X19)是第二代逆转录病毒转导的基于CD-28的CAR-T细胞产品(CD19/FMC63)，于2017年10月18日获得FDA批准，用于治疗成人R/R LBCL患者，包括DLBCL、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、HGBCL和转化滤泡性淋巴瘤(TFL)。在一项关键的1/2期研究Zuma-1(NCT02348216)中，101名患者接受了Yescarta输注，ORR和CR分别为83%和58%。
根据Zuma-5(NCT03105336)的结果，FDA于2021年3月3日批准了成人R/R FL患者在两个或更多系统治疗后的适应症。2022年4月1日，美国食品和药物管理局批准将Yescarta用于治疗在一线化疗免疫治疗(包括抗20单抗和蒽环类药物)后12个月内出现R/R，并打算进行大剂量的自体干细胞挽救治疗的成人LBCL患者。在Zuma-7(NCT03391466)试验中，ORR和CR分别为83和65%。
最近的研究(Zuma-12)也证明Yescarta作为成人高危LBCL一线治疗的安全性和有效性。2021年6月，Yikaida(FKC876)的商标在中国获批。
3.Tecartus(Brexucabagene)
Tecartus(Brexucabagene Autolucel)是第三种CAR-T细胞药物(CD19/FMC63)，于2020年7月24日首次获准用于治疗R/R套细胞淋巴瘤(MCL)患者。作为一项关键的2期临床试验，Zuma-2(NCT02601313)纳入了所有接受BTK抑制剂预治疗的MCL患者，他们的ORR为93%，CR为67%。该药的ORR较高，但3级以上ICAN的发生率达到31%，居同类药物之首。
2021年10月1日，FDA批准Tecartus用于治疗26岁及以上的R/R B-ALL成人患者。在Zuma-3(NCT02614066)2期试验中，55名患者接受了输液。其中39例(71%)出现CR或CR伴血液学不完全恢复。49例(89%)患者出现任何程度的CRS，其中≥3级13例，占24%。33例(60%)患者出现任何级别的ICAN(25%≥3级，14例患者)。
在制造方面，与Yescarta相比，Tecartus涉及T细胞选择和淋巴细胞富集，包括移除患者白细胞分离材料中周期性表达CD19的肿瘤细胞。MCL患者的起始样品中T细胞相对较小，而外周血中存在大量循环正在循环的肿瘤细胞和白血病母细胞。因此，移除这些细胞可能有助于提高成功率。
与前身Yescarta相比，Tecartus在ORR和CR方面均有改善，但CRS和ICAN的发生率也在3级以上。但如果Tecartus的毒性得到控制，它将是治疗血液系统肿瘤的理想药物。
4.Breyanzi (Lisocabtagene Maraleucel)
2021年2月5日，Breyanzi(Lisocabagene Maralecel)(CD19/FMC63)被FDA批准用于经过两个或两个以上的系统治疗（包括GBCL、PMBCL和3B级FL）的成人R/R LBCL患者，批准基于Transcend NHL 001(NCT02631044)的结果，旨在验证Breyanzi对R/R LBCL和MCL患者的疗效和安全性。在256名患者中，ORR 为73%，CR为53%，预估的一年有效率为65%。CRS发生率为42%(≥等级3，2%)，ICAN发生率为30%(≥等级3，10%)。
2022年6月25日，FDA批准Breyanzi用于治疗R/R LBCL。这次批准是基于第二阶段试点试验(NCT03483103)和关键第三阶段改造试验(NCT03575351)的结果。
在Transform试验中，90例患者接受了输液。有效率为86%(79例)，有效率为66%(61例)。49%的患者发生了CRS(只有1例患者有3级CRS)。12例患者(≥分级3级，4%)出现了ICANS。
与其他CAR-T细胞产品相比，Breyanzi含有一个非功能性的tEGFR，tEGFR与CD19特异性CAR在细胞表面共表达，因此可以作为CAR表达的替代品。在Breyanzi的制造过程中，从白细胞分离材料中挑选CD8+和CD4+T细胞，然后独立激活、转导和扩增。
制造过程中会产生克隆多样化、分化较少的纯T细胞产品(记忆T细胞)和低于量化水平的CD19+细胞。此外，CD8+和CD4+CAR-T细胞能以1：1的比例回输。这种固定转移剂量能加强对毒性的控制，从而提高持久性和扩增能力。
与使用其他药物时CRS和ICAN的3级以上发生率相比，Breyanzi具有更高的安全性和持久性。
5.Abecma (Idecabtagene Vicleucel)
Abecma(Idecabagene Vicleucel，bb2121)是FDA于2021年3月26日批准的第一个CAR-T细胞药物(BCMA/C11D5.3)。该产品可用于治疗经过四线或更多治疗（免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂和抗CD38单抗）的成人R/R MM患者。
共有140名被诊断为R/R MM并接受上述三种治疗的患者参加了KARMMA(NCT03361748)第二阶段研究。ORR和CR出现率分别为73%和33%。84%的患者出现了CRS，其中5%的患者发生3级或以上的反应。此外，18%的患者出现ICAN，其中3%为3级，无3级及以上神经毒性发生。
与其他产品相比，Abecma在3级及以上不良反应发生率方面有明显改善，但CR仍有提高的必要。
6.Carvykti (Ciltacabtagene Autoleucel)
作为2022年2月28日FDA批准的首个中国CAR-T细胞疗法(BCMA/VHHVHH)，Carvykti是全球第二个针对BCMA的CAR-T细胞疗法。与以往的CAR-T产品不同，Carvykti含有两个单域VHH抗体(VHH-VHH)，大大增强了对靶细胞表面BCMA的亲和力。
7.Relmacabtagene Autoleuce
Relma-Cel(JWCAR029)(CD19/FMC-63)作为二线及以上治疗方案适用于DLBCL患者。转导的自体CD4+和CD8+T细胞在Relma-cel中表达tEGFR和CD19特异性CARS。其表达的CAR结构与另一种CAR-T细胞产物Breyanzi(CD19/4-1BB/CD3-ζ)的结构类似。Breyanzi有很高的应答率。
在2期临床试验(NCT04089215)中，59例接受输液的患者中，47.5%的患者出现CRS，而CRS>3级的患者为5.1%。各等级的ICAN发生率为20.3%，3级以上ICAN的发生率为5.1%。ORR为75.9%，CR为51.7%。本试验证明Relma-cel 治疗R/R期LBCL的疗效与 Breyanzi相当，相关毒性低，疗效好。
8.其他CAR-T产品
自体BG1805(抗CLL1 CAR-T)被FDA授予治疗AML的孤儿药物（罕见药）称号。CLL1在儿童AML细胞和白血病干细胞中高表达，而在正常造血细胞中低表达。
在I期临床试验(ChiCTR1900027684)中，11名R/R AML（急性髓系白血病）儿童接受了BG1805治疗。体内扩增高峰时间的中位数为8天，这表明CAR-T细胞扩增迅速有效。11例患儿总有效率为81.9%，总的疾病控制率为90.9%。其中10例完全缓解，CLL1+AML癌细胞在1个月内消除。5例CR和微小残留病阴性(MRD−)，3例CR和MRD+，1例部分缓解(PR)，1例病情稳定(SD)。11例患者检测到3/4级不良反应，但未检测到剂量依赖性毒性。
一到三级CRS都有出现，但无死亡事件发生。CB-010治疗是CRISPR利用CRISPR杂合RNA-DNA(ChRDNA)技术进行基因编辑而建立的一种基于编辑的同种异体抗CD19 CAR-T细胞治疗方法。
基因编辑技术属于chRDNA技术。与CRISPR-Cas9相比，chRDNA具有高度的特异性和较低的非靶点编辑水平，允许多基因编辑和插入。CB-010治疗包括三个方面的基因编辑：
①定点敲除CD19CAR进入T细胞。
②敲除TRAC基因(T细胞受体α的恒定区)以去除TCR（T细胞(抗原)受体。
③敲除编码PD-1的基因。在它的第一次临床试验中，Cariou Biosciences报告说，5名可评估的患者的ORR和CR分别为100%和80%。在这项试验中，在治疗3个月后，4名患者出现CR，最长持续6个月。与以前的CAR-T细胞疗法相比，初步临床数据显示ORR和CR显著增加，CB-010质量剂量较低也更安全。
虽然CAR-T细胞免疫治疗可以显著改善临床疗效，但也会带来一些安全性和有效性相关的挑战，特别是CAR-T细胞治疗在用药后的毒性，如两种主要并发症细胞因子释放综合征(CRS)和免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)（CAR-T相关的脑病综合征(CRES）。
此外，还可能发生其他严重的不良反应，包括肿瘤溶解综合征和肿瘤靶外毒性（脱靶毒性）。为了提高治疗效果，目前已经开发了许多优化策略，包括调节CAR-T细胞的活性、与免疫检查点阻断抗体或小分子抑制剂联合使用。CAR-T免疫疗法展示出比单一药物疗法更好的临床效果。
随着基因组学和基因调控网络的技术进步，如单细胞测序等，帮助我们在理解CAR-T细胞的基因组景观方面取得显著进展。
近日，来自纳瓦拉大学的团队的研究表明CAR密度在CAR-T活性中起着重要作用，对临床反应有着显著影响。
我们已知影响CAR-T细胞功效的因素包括：
1. 外在因素，如抗原密度或肿瘤负荷信号。
2. CAR结构相关的因素，如共刺激域或铰链长度。
3. 内在细胞因子，如T细胞的分化状态，CD4 / CD8比率或T细胞多功能性。
4. 具有耗竭表型的T细胞的增加可能导致CAR-T细胞的持久性降低，临床反应下降。
CAR-T细胞表面的CAR密度影响CAR介导的信号传导
目前的CAR-T细胞产物是使用逆转录病毒/慢病毒（LV）载体产生的，这些载体在细胞内产生不同水平的转导和转基因表达，从而观察到转导细胞表面上的各种不同的CAR分子密度。
为了确定CAR密度是否会影响CAR介导的信号传导，从而影响CAR-T细胞功效。研究人员首先在Jurkat细胞中使用三重参数报告器（TPR）系统，通过流式细胞术测量CAR介导的主要信号通路的激活。Jurkat-TPR细胞靶向BCMA， 4-1BB作为共刺激结构域，用报告基因（EGFRt）进一步修饰，便于测量CAR水平。
然后，根据EGFRt的荧光强度(FI)区分不同水平CAR的Jurkat -TPR细胞亚群(称为CARHigh和CARLow细胞)。并与表达不同BCMA的MM细胞系共培养后进行分析，可以观察到CAR内三种途径的激活水平显著增加。
CAR密度影响靶向BCMA的CAR-T细胞的抗肿瘤反应
为了进一步分析CAR密度对抗肿瘤功效的影响，表征了来自10个健康供体的CAR-T细胞，这些细胞采用BCMA靶向CAR构建体（来自ARI-0002h）共表达蓝色荧光蛋白（BFP）。
基于BFP表达，将CAR-T细胞分选为CARHigh和CARLow细胞亚群。
CARHigh T细胞：细胞毒性活性增加，干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）和颗粒酶B（GZMB）的产生水平更高。
接下来，研究人员分析了CAR的表型。观察CARHigh T和CARLow T细胞在用肿瘤细胞刺激之前和之后的表型变化，发现CARHighT细胞的基础激活增加，人白细胞抗原（HLA）-DR和CD137细胞的水平显著升高（图8E、F），以及表达两种或更多种耗竭标志物（LAG3，TIM3和/或PD1）组合的CD8+T细胞的百分比显著升高。
用肿瘤细胞连续重复体外刺激21天，发现CARHigh T细胞和CARLow T细胞分化和耗竭表型差异显著，并且CARHighT细胞损失严重。
总体而言，这些结果表明 CARHigh T细胞增加细胞毒性和CAR信号传导。此外，在CARHigh T细胞中观察到的分化和耗竭的表型更多，导致在刺激条件下体内抗肿瘤作用降低，这可能对临床反应产生影响。
CARHighT细胞显示出不同的转录组和染色质景观
深入研究CAR-T细胞的两个亚群（CARHighT细胞和CARLow T细胞）的转录组和表观遗传景观，CARHigh T细胞显示出与淋巴细胞活化相关的基因（如HLA-DRA，CIITA和CD74）以及共刺激分子（如CTLA-4，TNFRSF4（OX40）和TNFRSF9（4-1BB）的表达增加。
表现出差异和染色质可及性的基因主要与T细胞活化和共刺激有关。
总之，这些结果表明，与CAR水平升高相关的基因表达和染色质可及性的微小差异可以显著改变CAR-T细胞的整体表型和功能特征。
单细胞测序揭示了CARHigh T细胞的CAR特异性分布
为了更好地了解CAR-T细胞的异质性以及CAR水平对其转录组学的影响，研究人员对来自三个独立生产的43981个CAR-T细胞进行了单细胞转录组分析。
在质量控制和过滤后，研究人员进行综合分析，并确定了23个CAR-T细胞亚群集群。根据表型结果，研究人员鉴定出一个预先耗竭的CD8 CAR-T细胞簇，其特征在于细胞毒性基因的表达以及抑制性受体，如LAG3和TIGIT。
CAR密度与监管网络的差异激活有关
为了阐明CAR的分子调控机制，研究人员应用了SimiC，这是一种用于scRNA-seq数据的新型GRN推理算法，在共同推断每个特定细胞状态的GRN时施加相似性约束。SimiC的GRN分析提供了表型和功能差异背后的监管网络。
CARHighT基因特征与临床反应相关
研究人员推断CAR密度可能对CAR-T细胞疗法在临床反应中产生影响。由图观察到，CD4+和CD8+CARHighT细胞在来自临床反应不佳的患者（PR/NR）中均显示出更高的分数。
研究人员还评估了来自24名DLBCL患者的抗CD19 CAR-T输注产物的T细胞特征。发现，来自无反应患者（PR/NR）的输注产物显著富集CD8+CARHighT细胞，支持CAR密度与临床反应之间的相关性。
与严格意义完全缓解（sCR）的患者相比，部分缓解（PR）的患者CARHigh T细胞数量增加。
总体而言，数据表明，在膜上具有高CAR密度的CAR-T治疗产品会对临床反应产生负面影响。
想要在化疗后体内T细胞耗尽的晚期CLL患者中取得理想疗效，CAR-T细胞疗法面临很大挑战。最近，孔令辉等人证明BET蛋白（超末端结构域）可以破坏CLL患者T细胞的CAR表达和关键的乙酰化组蛋白功能。抑制BET蛋白抑制TET2甲基胞嘧啶双加氧酶水平，强制表达TET2催化结构域消除增强靶向BET蛋白在CAR-T细胞中的作用。
基因组编辑技术是推动CAR-T治疗进步的重要因素。通过慢病毒传递的CRISPR/Cas9可用于敲除肿瘤细胞中的内源性TCR(ETCR)，以增强T细胞的自然能力。此外，CRISPR/Cas9介导的CD19-CAR-T细胞中的eTCR基因敲除可以避免移植物抗宿主病(同种异体反应)的风险，然而，CAR-T细胞的eTCR基因敲除可能会缩短反应的寿命。
CRISPR/Cas9也可以与腺相关病毒载体结合使用，以定向整合到特定位置。此外，基因组编辑技术可以用于CAR-T细胞的制造。在最近的一项研究中，研究人员为非病毒CAR-T制造开发了一种与制造实践兼容的良好工艺。研究人员开发了含有Cas9靶序列(CTS)的单链DNA同源定向修复模板，毒性较低，可将敲入效率(46-62%)和产量(>1.5×109修饰细胞)平均额外增加约两到三倍。
CAR-T细胞的功能依赖于肿瘤和工程T细胞之间的相互作用。然而，作为活的药物，CAR T细胞是异质产物，其中内在和外在因素可以影响其功能，从而对其临床疗效产生显著影响。本文确定了影响CAR-T细胞功能的新决定因素——CAR表达水平。
高水平的CAR表达与增强的CAR信号和细胞耗竭表型有关，其特征在于多种抑制性受体的表达，如PD1，CTLA4，LAG3，TIM3和TIGIT等，本文研究也表明在不同的血液系统恶性肿瘤中，CARHigh T水平升高的患者临床反应下降。
