本文综述了应用于ADC类药物纯化的几种工艺：超滤渗滤（UFDF）、尺寸排阻色谱（SEC）、疏水色谱（HIC）、羟基磷灰石层析（HA）以及膜层析（MC）并展望未来ADC类药物纯化方向，可为ADC类药物下游工艺开发提供指导。

总结了当前ADC纯化的常用策略，并比较不同方法优势以及缺点，并对ADC未来研发策略做出展望。

抗体偶联药物（ADC）

抗体偶联药物（Antibody–Drug Conjugates，ADC）是一种将细胞毒性药物偶联到单克隆抗体而构成的复合体。ADC类药物不仅可以通过单克隆抗体特异性识别肿瘤表面抗原，还可以利用自身携带的高效小分子药物毒素杀灭肿瘤靶细胞，结合了靶向药物和化疗药物的优点，因此近20年来逐渐成为研究的热点。

然而，由于复杂的结构使得其研发生产工艺的难度大大增加，与抗体类药物相比，ADC类药物下游纯化过程中更加需要关注药物抗体比（drug-to-antibody ratio，DAR）、单一连接子（Linker）以及聚集体的残留量等指标。

在过去20年间ADC类药物的研发成为各大药企竞争的热点，已经有超过10种ADC类药物已经获得FDA的批准，另外还有百余种ADC类药物处于临床试验或者药学研发阶段。因此开发出稳健的ADC平台化工艺流程对各大制药企业来说至关重要。

ADC类药物主要由三个部分组成

负责选择性识别肿瘤细胞表面抗原的抗体，有效载荷（payload，如：负责杀死肿瘤细胞的小分子细胞毒药物），以及连接抗体与有效载荷的连接子（linker）。

ADC 药物依靠抗体对肿瘤细胞相关抗原的特异性和靶向性而到达肿瘤细胞，并且通过内吞作用进入该细胞，连接子在细胞内受到低 PH 值或溶酶体酶促反应等作用下断裂，释放出有效载荷，从而导致肿瘤细胞死亡。理想的 ADC 药物在血液循环中应保持稳定性和完整性，精准地到达治疗目标，并最终在目标（肿瘤细胞）内释放有效载荷。

1.靶抗原

与传统的细胞毒性化疗药物不同，ADC 药物通过靶向具有足量抗原表达的肿瘤细胞来递呈有效载荷，以达到扩大治疗窗的目的。

目前，ADC 药物的靶抗原的选择已逐渐从传统的肿瘤细胞抗原扩展到肿瘤微环境中的靶抗原，例如基质和脉管系统等，可以作为 ADC 药物未来开发的有价值的靶抗原。

同时，为了提高靶向的精准性，在选择靶抗原时，通常选择仅在肿瘤细胞中表达或仅在肿瘤细胞中高表达，而在正常组织中不表达或很少表达的抗原，或者至少限定在某些特定的组织中。

选择的靶抗原应该有胞外域且为非分泌的，即靶抗原应该在肿瘤细胞表面表达，且在体循环中没有游离的靶抗原，从而避免由于循环中存在分泌的游离抗原致ADC结合到肿瘤部位之外的地方，从而导致ADC靶向性降低，引发安全性问题。ADC药物上相应的抗体部分与目标抗原结合后应该被有效内化，从而实现向细胞内精准递送有效载荷。

2.抗体

靶向抗原的抗体对于ADC的特异性结合至关重要。理想的抗体应与靶抗原的结合具有高度特异性、高亲和力，还应可以促进有效的内化，在体内表现出低免疫原性并且保持一定时长的药物半衰期，同时也需关注抗体本身是否具有一定的抗肿瘤活性。

此外，需要关注的是，较高的亲和力会导致更快的内化，但同时也可能降低抗体对某些实体瘤的渗透；同时抗体的分子量大小也会影响肿瘤穿透效率。因此，需要根据肿瘤的细胞结构特点，在靶细胞的快速结合和内化效率的平衡中，选择与抗原表位亲和力恰当、分子量大小适当的抗体。

3.连接子

连接子作为将抗体与细胞毒性药物连接起来的桥梁，对于ADC的稳定性、有效载荷释放曲线有着显著的影响，从而影响药物疗效和安全性。目前，通常可将连接子的类型分为可裂解型和不可裂解型。对于可裂解型的连接子，需关注其是否足以识别循环系统和肿瘤细胞之间的环境差异，从而准确地释放游离的细胞毒药物。

对于不可裂解型连接子，其最大优势在于可以降低脱靶毒性，但因其产生的游离有效载荷是亲水的且具有更低的膜渗透性，相应较难发挥有效载荷的旁观者效应。理想的连接子能够与抗体有最佳结合位点，不诱导 ADC 聚集，生理环境中保持稳定不易断链，到达肿瘤细胞中后有效释放。不同类型的连接子各有优势，在设计 ADC 药物时可以根据需求进行选择。

4.有效载荷

有效载荷是在ADC内化到肿瘤细胞后发挥作用的小分子药物，目前最常使用的是小分子细胞毒药物。有效载荷是决定 ADC 药物杀伤力大小的关键因素，通常宜选择毒性效价高、生理条件下稳定、潜在药物相互作用（DDI）小、且可发挥旁观者效应的疏水性小分子药物。

5.偶联方式

有效载荷与抗体的偶联方式也是构建 ADC的重要因素。偶联方式将影响药物-抗体比 (drug-antibody ratio，DAR) ，以及 DAR 的分布特征。在选择偶联方式时，通常需要兼顾考虑偶联方式的稳定性和 DAR值的均一性；同时，还需要关注偶联位点是否会对ADC抗体与目标抗原的结合、ADC的PK和其他特征产生影响。

ADC类药物纯化过程可分为两类

1.切向过滤（TFF）：超滤渗滤 (UFDF)。

2.层析：尺寸排阻色谱（SEC）、疏水色谱（HIC）、羟基磷灰石层析（HA）以及膜层析（MC）。

①切向流过滤（TFF）

切向流过滤中的超滤渗滤（UF/DF）工艺，已经广泛应用于ADC类药物的纯化工艺中。由于用于去除有机杂质、偶联相关杂质以及用于缓冲液的置换（通常需要将单克隆抗体置换到适合的缓冲液中进行偶联药物）。

此外，UF/DF作为ADC纯化过程中一种工艺其收率也可保持在90%以上，相关研究表明小分子杂质（有机杂质、偶联相关杂质）分子量要低于膜孔径，因此过滤过程中pH、膜载量、跨膜压差以及流速对于小分子杂质去除影响较小，工艺具有较强的稳健性。

值得注意的是，在一些特殊的案例中由于连接子复合物具有较高的疏水性，在缓冲液中有可能发生自缔合作用，产生难溶性胶束，这些胶束则难以通过UF/DF步骤去除，通常需要配合后续相关层析工艺进行去除。总的来说UF/DF工艺对于ADC类药物的纯化来说是稳健且通用的方法。

但是UF/DF本身也具有一定的缺陷：

1.由于聚集体的分子量较大（通常和ADC的分子量相当甚至分子量大于ADC的分子），因此使用UF/DF系统难以去除聚集体类的杂质。

2.UF/DF难以区分不同的载荷量（DAR），因此UF/DF过滤之后为不同DAR的混合物，仍需要进一步纯化。

②尺寸排阻色谱（SEC）

尺寸排阻色谱是一种基于分子量差异而进行分离纯化的一种层析方式，对于ADC类药物的纯化来说具有至关重要的作用。

SEC在ADC纯化过程中可以起到缓冲液置换（脱盐）、去除非蛋白杂质（小分子杂质，如小分子细胞毒性药物）、以及去除聚集体等作用。此外SEC通常在较为温和的条件下进行层析（中性pH缓冲液以及室温条件），有利于ADC类药物维持稳定。

因此，SEC是ADC纯化的一种金方法。通常我们选择SEC来进行纯化时，通常假设没有二级作用即ADC分子与SEC填料没有别的相互作用力如疏水力以及离子作用力，然而事实有多篇研究报道ADC分子与SEC填料存在相互作用，因此在工艺开发，填料筛选阶段我们需要尽可能选择相互作用小的填料来进行工艺开发。

③疏水作用色谱（HIC）

ADC类药物的纯化除了应该关注小分子类杂质、聚集体外还应该注重DAR（药物-抗体比率）类杂质的去除。对于DAR类的杂质由于SEC层析岁DAR的分辨率较低，因此DAR类的杂质通常需要通过疏水作用色谱来进行去除。

由于ADC药物共价偶联了疏水性药物连接子（Linker），因此ADC类药物与单克隆抗体以及不同DAR值的杂质具有疏水性差异，因此可以通过疏水层析进行去除。如基于半胱氨酸偶联的ADC，DAR<8,通常会产生五种不同的产物（即DAR=0,2,4,6,8），对于情况可以通过疏水作用色谱结合线性梯度进行分离。

通常来说可以在层析缓冲液中添加硫酸铵来辅助疏水层析过程中对目标产物的捕获，然而在ADC类药物纯化的过程中，硫酸铵的添加往往会导致收率偏低，因此针对这种情况可选用疏水性较弱的NaCl来克服上述问题。

综上所述，使用HIC来对ADC类药物进行纯化，对DAR类杂质具有较好的分离效果，但是HIC层析仍然有峰分辨率低、收率偏低的问题，需要在工艺开发阶段着重优化。

④离子交换色谱（IEC）与羟基磷灰石层析（HA）

离子交换色谱和羟基磷灰石层析常常应用于单克隆抗体的纯化过程中，但是将这两种工艺应用到ADC类药物实例较为有限。其中离子交换色谱通过目标产物与杂质电荷差异来进行分离纯化，可以应用于小分子类杂质、宿主DNA、内毒素以及电荷变异体等杂质的去除，因此离子交换是ADC类药物精纯阶段具有潜力的候选工艺。

而羟基磷灰石层析，在ADC类药物去除聚集体的方面表现较为出色（有研究表明采用羟基磷灰石层析可以使抗体中聚集体的含量由纯化前的60%下降到0.1%），综上所述，离子交换色谱以及羟基磷灰石色谱展现出一定ADC药物纯化的潜力。

⑤膜层析（MC）

相比于传统的柱层析的诸多缺陷（收率较低、IEC,HIC层析时通常需要一定浓度的盐来进行洗脱，盐的存在不利于样品的稳定储存），膜层析则收率较高、并且通常流速也较高，可缩短工艺时间节省成本。

因此，有研究人员将目光转向膜层析，希望以此来代替传统的柱层析。有研究表明使用Sartobind membrane来对ADC类药物进行纯化的时候，可以有效去除聚集体以及药物连接子。进一步研究表明将含有不同作用模式的层析模，进行串联的时候可相互促进从而增强纯化效率。

例如将SEC和HIC膜进行串联时，SEC膜的脱盐作用可以促进HIC膜对DAR类杂质的分离作用。类似地，有研究将Sartobind S and Sarto bind Phen两种膜进行串联，后可在高流速，低压力的条件下去除聚集体。相信随着技术的进步，这种无需层析柱的膜层析将会在ADC类药物纯化工艺中大放光彩。

ADC药物的疗效特点

1. 同一靶抗原不同药物间疗效的差异

基于作用机制，ADC药物的人群选择策略主要集中在肿瘤细胞上靶抗原表达方面，但针对同一靶抗原不同ADC药物在不同瘤种中的疗效各异：

①由于 ADC 药物结构和作用机制的复杂性，其疗效与抗体、连接子和毒素成分及其与肿瘤及微环境间的相互作用有密切关系，造成了针对同一靶抗原的不同药物在各瘤种中的疗效迥异。

②在不同的肿瘤组织学类型中，存在靶抗原的异质性、潜在肿瘤基因组的复杂性等差异，均会影响 ADC 药物的递送以及抗肿瘤活性。

2. 同一药物针对不同靶抗原表达状态疗效的差异

由于ADC的抗体主要发挥靶向定位作用，把有效载荷精准地带至目标细胞内杀死肿瘤细胞，在这一过程中，有些药物还可产生旁观者效应（bystander effect），因此ADC可能不仅对靶抗原高表达肿瘤有效，对靶抗原中、低表达的肿瘤细胞是否具有抗肿瘤活性，也值得进一步探索。

以目前进行的 ADC 药物临床试验的研究数据来看，某些 ADC药物对于靶抗原中低表达的肿瘤也具有一定的抗肿瘤活性，如已有靶向 HER2 抗原的ADC药物在临床试验中证实其对于 HER2 低表达的肿瘤也具有明确的疗效。

3.最佳给药方案的探索

合理的给药策略是影响 ADC 药物获益风险特征的关键因素。基于ADC药物的结构特征和作用特点，有效载荷毒性是主要的剂量限制因素，有效载荷系统暴露量相对较小程度的增加就有可能导致显著的不良反应。

最佳给药策略的选择需综合考虑抗体和有效载荷之间的 PK、PD 差异，因此，在早期研究阶段全面了解 ADC 药物及其组成部分的 PK 和 PD，以及尽可能探索其与安全性和有效性结果之间的关系非常重要，从而及时合理调整给药方案。例如，对由于血清峰浓度过高引起主要毒性的 ADC，可以采用有效低剂量的分次给药策略，降低血清峰值浓度，从而提高安全性和耐受性。

4.关注脱靶的安全性风险

在ADC药物临床研发中，其安全性管理至关重要。对于ADC药物来说，抗体的特异性、连接子的稳定性、有效载荷的性质等因素都可能影响药物的安全性，使其具有单纯有效载荷不同的毒性特征。与靶向相关的安全性风险相比，脱靶相关的不良反应在多数情况下可能是 ADC不良反应的主要因素。

导致脱靶毒性的原因，可能包括：a、有效载荷释放到血液循环中（例如：由于连接子不稳定或细胞外蛋白酶使得载荷在细胞外释放）；b、非特异性内吞机制（例如巨胞饮作用和微胞饮作用）及受体依赖的内吞机制，能内化整个ADC或游离载荷；c、旁观者效应等。

同时，脱靶毒性与载荷所属类型或作用机制并不一定有特异的关联，如一甲基澳瑞他汀 F（MMAF）和一甲基澳瑞他汀 E（MMAE）都属于微管蛋白抑制剂，但是 MMAF眼毒性常见，而 MMAE 眼毒性发生率并不高，但贫血、中性粒细胞减少等发生率较高。上述原因导致在具有相同靶抗原或有效载荷的情况下，不同的ADC类药物可能呈现出不同的安全性特征。