为什么要严格控制生物制品中宿主细胞DNA的残留？

宿主细胞是生物制品的基石，许多生物制品如疫苗、基因治疗产品、重组抗体药/蛋白药等均需用到动物细胞、细菌或酵母作为宿主细胞进行生产。

常见的宿主细胞有中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、人肾上皮细胞（HEK 293）等和常见的微生物如大肠杆菌（E.coli）和酵母菌等。

虽然经过严格的纯化工艺，但成品中仍可能有宿主细胞DNA的残留，而这些残留的DNA可能具有潜在的致瘤性和/或传染性风险，因此，需严格的控制生物制品中宿主细胞DNA的残留。

主要的风险种类包括：

1.潜在感染性风险

核酸残留可能存在感染性病毒基因，后者能通过复制和转录扩增并产生感染性病毒粒子。

2.潜在致瘤风险

残留的宿主细胞核酸可能会在人体内造成细胞增殖失控，变为肿瘤细胞。

3.潜在引发免疫副反应

例如CpG-rich sequences from bacteria，可能通过TLR（Toll-like receptors）介导引发免疫反应。

4.潜在基因转座或重组风险

例如Retrovirus-like elements with terminal repeats（LTRs），病毒基因组内的LTR可转移到细胞原癌基因邻近处，使这些原癌基因在LTR作用下被激活，将正常细胞转化为癌细胞。

宿主细胞DNA的残留量的标准是什么？

我国药典（2020年版）三部中明确的列出了各类生物制品中外源DNA残留量的要求，如冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）采用荧光定量PCR法进行原液检定，Vero细胞DNA残留应不高于3ng/剂；重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）中CHO细胞DNA残留量应不高于10pg/剂。

我国国家药品监督管理局药品审评中心发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》中提到 “生产若使用了肿瘤细胞系（如 Hela细胞）、致瘤细胞系，或携带有致瘤基因、病毒来源序列的细胞（如 HEK 293T细胞），在确保无完整活细胞残留的同时，需对DNA的残留量和残留片段大小进行控制，合理拟定标准限度。如有可能，建议尽量将残留DNA控制在10ng/剂以内，DNA残留片段的大小控制在 200bp以下。” 

怎么检测宿主细胞DNA的残留量？

对宿主细胞DNA残留量的检测，我国药典（2020年版）三部通则推荐了三种方法，包括DNA探针杂交法、荧光染色法及定量PCR法：

1.DNA探针杂交法

供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上 ，在一定条件下可与相匹配的带探针标记的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA。

2.荧光染色法

应用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物，在波长480nm激发下产生超强荧光信号，用酶标仪检测520nm处的荧光信号。荧光强度与DNA浓度成正比。

3.定量PCR法

在PCR反应过程中，通过荧光标记的特异性探针或荧光染料引起的荧光数值的变化，检测产物量的变化，从而对模板进行定量分析。

其中定量PCR法以特异性好、灵敏度高、准确性好、易于高通量等优势被广泛采用。