AAV是基因治疗的极其通用的输送载体。从FDA批准的遗传性视网膜疾病的治疗药物Luxturna，到血友病、脊髓性肌肉萎缩等疾病的治疗，这种病毒很可能在未来的医学中发挥核心作用。但基因治疗仍然是一个相对年轻的领域，科学家们持续在基于AAV的产品开发中发现新的变量和复杂性。

AAV可以将DNA直接递送到患者细胞核，基因治疗的开发涉及含有目的DNA序列的重组AAV（rAAV），而不是天然AAV。开发者必须纯化病毒颗粒，以消除不含靶序列的污染物和AAV病毒颗粒，但这些纯化步骤并不完美。以下是AAV开发人员面临的五大生物工艺挑战，这些问题需要逐步的质量控制措施来监测和解决，通过彻底的质量控制，开发人员可以确保生产安全有效的基因治疗产品。

低载体浓度

为了使基因疗法有效和安全，每批rAAV需要达到一定的载体浓度。标准的上游工艺流程通常可以得到每个细胞2×1014个载体基因组的浓度，但基因疗法需要的载体浓度高达每个细胞1×1017个。

因此，病毒需要浓缩100到10000倍。这就带来了两个挑战：首先，大多数商业化的生物反应器没有处理浓缩AAV载体所需的小体积配置。其次，浓缩载体也意味着浓缩批次中的杂质。因此，测试每个批次中载体和杂质的浓度至关重要。

空壳

由于将目的基因递送到rAAV衣壳中的过程效率较低，通常导致大量空病毒载体产生，这些空载体最多会占该批次的90%，极大地降低治疗的有效性，因此就要求患者接受更高的给药剂量1,2。

而高剂量需要更高的递送量，这可能对将药物递送到身体的某些部位（例如中枢神经系统）构成挑战3。因此在生产过程中需要去除空衣壳，以达到合理的活性载体滴度，并通过质量控制来确认较低的空壳率。

宿主细胞DNA的致癌性

用于培养rAAV载体的细胞系会包含致癌性的DNA序列，这些序列可能进入最终的基因治疗产品。

当开发者使用致瘤细胞系来培养载体时，他们必须在纯化过程中尽可能减少DNA残留，然后检测载体中是否存在致癌基因，几乎不可能在含有宿主细胞DNA的载体中中和这些致癌片段。因此必须进行特定的检测，以确认这些载体不会导致癌症。

杂质蛋白的免疫原性

科学家普遍认为，rAAV的免疫原性低于其他病毒载体，因为它们不含任何可能引起免疫反应的脂质或其他化合物。

然而，衣壳蛋白本身可以引起反应，最终可能降低治疗的有效性2,4。除了对病毒的固有免疫外，许多人已经暴露于AAV，因此可能已经对它们产生了适应性免疫反应，目前尚不清楚是否是空壳病毒导致这个问题，或者这些空壳病毒是否真的充当诱饵使得患者的免疫系统不对活性病毒颗粒产生反应。目前尚无法规可解决此问题，需要进一步的研究来澄清这些问题，并尽可能降低免疫原性的风险。

从细胞中收获rAAV

由于许多原因，rAAV可能难以从其宿主细胞中纯化，从而导致生产过程慢且昂贵。在某些情况下，rAAV衣壳倾向于留在宿主细胞中，这意味着基因治疗开发人员需要破碎细胞以将衣壳取出，以便将其纯化。而破碎细胞的方法可能导致其他杂质的释放。在某些情况下，AAV颗粒会粘附在细胞膜或宿主细胞中的其他杂质上，导致产率低或杂质多。这些额外的杂质会堵塞过滤器，带来额外的纯化挑战。

目前，商业化纯化rAAV载体所需的大多数技术已经稳定，但是很少有明确的指导方针可以解决具体问题，例如纯度和安全性，开发者必须自己创建检测方法。因此需要一种可靠的方法在生产过程的每个步骤中检测病毒滴度和残留DNA，以确保他们生产出高质量的产品。

微滴式数字PCR技术提供了AAV基因治疗的质量控制中多方面所需的准确性，尤其用于病毒定量优势显著，不仅可以摆脱标准品的限制进行绝对定量，还可以减少样品前处理步骤，得到更精确的定量结果。同时在宿主残留核酸检测中具有高灵敏度的优势，可提升制品的安全性。