基因治疗的现状

基因治疗有可能通过改变生命的基本组成部分来恢复或增强细胞功能，从而治愈最严重的疾病并延长人类寿命。尽管前景广阔，但该领域尚未充分发挥其潜力。

迄今为止，上市的少数疗法均针对罕见的单基因疾病，而且治疗具有挑战性；基因治疗主要离体进行，需要在培养中编辑患者细胞然后重新回输的方法。与大多数移植手术一样，患者在接受离体基因治疗之前，必须进行免疫系统消融，可能会产生严重的副作用。给药还需要专门的医疗培训，并在专用设施中进行，导致成本太高，无法被付款人作为常规选择。

基因治疗已经克服了多个瓶颈：

1.识别导致特定疾病的遗传变异，曾经是一个非常缓慢和费力的过程。通过大数据和基因组学，现在靶点识别相对快速且直接。

2.1990 年代的第一代基因疗法主要涉及将功能性基因序列递送到细胞中，但新的精确编辑技术（如 CRISPR-Cas9、碱基编辑和引导编辑）意味着对 DNA 进行所需的修饰不再是一项技术瓶颈。

3.可以并行编辑多个基因的现代多重疗法意味着基因疗法的应用首次可以扩展到相对罕见的单基因遗传疾病之外，为治疗肿瘤或糖尿病等常见复杂疾病开辟了可能性。

最后一个瓶颈是在体内安全有效地递送基因治疗构建体，通过实现直接注射和精确靶向来解决基因治疗递送问题，将通过帮助将各种疾病的新疗法和治疗策略带入每家医院来改变基因治疗领域。

理想的基因治疗载体标准

1.安全

患者安全性至关重要，导致严重副作用的基因治疗工具不是可持续的选择。作为该安全标准以及监管机构的化学、制造和控制 (CMC) 要求的一部分，递送载体必须具有一致的物理和化学特性以及质量。

2.可重复的体内给药

至关重要的是，下一代基因疗法在标准临床环境中以简单的注射方式实施，而不需要高风险的免疫系统消融和相关的长期住院治疗。由于某些基因疗法需要使用一剂以上，因此理想的体内应用递送载体将需要具有“免疫特权”。没有它，免疫系统会将治疗的第一剂视为外部威胁，就像它识别传染病一样，触发攻击和破坏后续剂量的反应，将治疗限制为单性治疗。

3.高容量

现代基因治疗技术不断提高的精度和多路复用能力通常意味着更大的载荷，不仅包括 DNA 或 RNA 分子，还包括催化它们在细胞内使用的蛋白质。理想的递送载体将能够封装和递送不同类型的基因治疗有效载荷。

4.可靶向

不同疾病的治疗需要不同的细胞类型特异性（细胞嗜性）。长效治疗和永久治愈通常需要针对干细胞和祖细胞。

满足所有这些标准的解决方案将通过提供一种更简单、更安全的方法来提供治疗和治愈作为多种疾病的护理标准，从而使基因治疗“民主化”。

病毒载体的挑战

自三十年前基因治疗领域出现以来，基因治疗递送市场一直由病毒主导。病毒的吸引力是显而易见的：它们可以将 DNA/RNA 载荷运送到人体细胞中；它们有不同的尺寸，适合各种载荷类型；并且它们具有先天的（可能也是广泛的）血清学嗜性。但它们也有明显的缺点。

病毒载体的主要缺点与可重复性和安全性有关。人类免疫系统已经进化到对病毒载体产生强烈反应，这对需要在体内重复给药的基因疗法构成了重大挑战。免疫反应也会引起副作用，其中一些可能是严重的，甚至是致命的。与病毒载体有关的其它安全问题包括可激活癌基因，并产生其它意外影响的插入诱变，以及在生产过程中可能产生不一致的产品的意外和不可预测的分子变化。对于许多体内应用，病毒载体也没有足够的靶向细胞嗜性和生物分布。

尽管许多研究团队仍在努力开发用于基因治疗的改进型病毒递送载体，但基因治疗领域的未来可能在别处。有多种候选策略可以替代病毒作为基因治疗的首选载体，每种策略在上述标准方面都有优点和缺点。

1.合成性纳米颗粒

行业已经开发基于脂质、蛋白脂质和其它聚合物的合成纳米颗粒，以设计一种更安全、更具靶向性的载体。脂质纳米颗粒 (LNP) 是最常见的一类，在 COVID-19 大流行期间作为用于递送Pfizer-BioNTech 和 Moderna 生产的 mRNA 疫苗的载体而备受关注，但该技术有多个版本，具有不同的特性。

可重复性和安全性：合成纳米颗粒技术在最初的临床批准之前经历了多次迭代，并且在递送效率、短期安全性和免疫系统反应之间进行了权衡。与病毒载体相比，目前这一代合成颗粒具有更好的安全性，尽管一小部分人群可能会对某些配方的成分产生免疫、炎症或（非常罕见的）过敏反应。然而，对于大多数人来说，合成颗粒比病毒载体表现出更好的免疫特权，允许有限次数地重复给药。在 CMC 方面，可以大规模制备一致的合成性纳米颗粒产品。由于最近在 COVID-19 疫苗中的成功使用，公众对 LNP 的接受度普遍很高。

容量：LNP 具有中等承载能力，大致相当于慢病毒载体，而蛋白脂质载体 (PLV) 可以封装较大的载荷，大致介于慢病毒和腺病毒之间。因此，它们可以封装大多数（但不是全部）当前的载荷类型，并且随着载荷尺寸的不断增加，可能需要新一代、更大的颗粒。

靶向性：虽然合成颗粒没有先天的细胞嗜性，但它们主要在肝脏中积累，因此具有为肝脏疾病提供基因疗法的强大潜力。通过化学或静电修饰或细胞表面蛋白的掺入，可以在一定程度上设计其它细胞趋向性和生物分布特性。然而，其中一些修饰会增加毒性并降低免疫特权，同时引入与 CMC 相关的挑战。由于天然细胞趋向性是由对细胞表面蛋白质复杂组合的识别所驱动的 - 不像一把锁上的一把钥匙，更像是一次秘密“握手” - 这种有限的工程化趋向性通常只适用于少数特定的细胞类型，并且可能具有在体内的不可预测性。

2.生物源性颗粒

生物源性颗粒可细分为2种不同的亚型，可用作基因递送载体：外泌体，来源于细胞内部，是第一代非病毒基因递送公司的基础，以及微泡，它们从细胞表面膜发芽并且更容易表征，但具有讽刺意味的是，它是这个领域的新进入者。作为人体细胞间通讯网络的一部分，这些细胞外囊泡 (EV) 具有封装人类 RNA、DNA 和蛋白质的先天能力，并将这些载荷有效地输送到其它细胞中 - 比 LNP 和其它合成颗粒效率高几个数量级。

将 EV 作为疗法的许多早期工作都集中在源自间充质干细胞的外泌体上，因为这些外泌体很容易获得，并且可以包含干细胞本身的一些再生和其它有益特性。与此同时，开发用于从培养细胞大规模制造血细胞和血液制品的系统的研究人员也开始了解细胞外囊泡在造血细胞之间转移核酸和蛋白质的作用。由于这些基础工作，外泌体和微泡最近进入了开发阶段，可作为基因治疗的载体，特别是针对造血干细胞和祖细胞的应用。

可重复性和安全性：EV 是体内几乎每个细胞都会产生的天然产物，因此与病毒和合成颗粒相比，具有显著的安全性和免疫特权优势，允许在体内重复给药次数更多，副作用更少。由于 EV 从多种类型的细胞中自然分泌到血液和其它体液中，因此它们已经存在于曾经进行的每次输血和器官移植中，早在它们正式发现和表征之前就开始了；它们也存在于其它生物制品中。此外，人体自然会使用 EV 重新包装和运输通过 LNP 和其它合成颗粒输送到培养细胞中的载荷，例如，将 mRNA 从疫苗注射部位的肌肉细胞输送到身体其它部位的免疫系统细胞。这段悠久的历史证明了他们的安全。

这2种形式的EV都可以很容易地从液体细胞培养中大规模生产。外泌体的小尺寸确实给产品表征和质量控制带来了挑战，因为传统的分析工具无法准确表征尺寸小于约 100 nm 的颗粒。因此，在改进的分析工具可用之前，外泌体将继续面临与 CMC 相关的重大监管批准障碍。相比之下，微泡没有这种限制，并且可以以更一致的特性和更大的规模制备。

容量：外泌体较小，这限制了它们可以携带的载荷类型。微泡更大，携带能力与腺病毒相似并且可能大于腺病毒。因此，它们可用于递送各种载荷，包括多重基因编辑应用所需的更大构建体。

靶向性：外泌体具有有限的已知表面生物标志物，因此与 LNP 和其它合成囊泡存在相同的细胞趋向性问题，尽管与 LNP 一样，可以设计一定程度的趋向性。相反，当微泡从细胞表面膜出芽时，它们继承了由其亲代细胞表达的表面蛋白的复杂组合。因此，源自不同细胞类型的微泡具有不同的细胞嗜性，使其成为多种基因治疗应用的高度可调选择。选择的微泡可以自然地归巢于骨髓和其它部位的造血干细胞，为长期体内治疗甚至治愈一系列遗传性造血疾病提供了前景。一些微泡甚至具有穿过血脑屏障的先天能力，这可能允许使用其它方法靶向极难靶向的细胞类型。可以对培养的源细胞进行基因工程改造，以根据需要敲除或修饰任何细胞表面蛋白，提供比其它递送工具类型更进一步、更特异和可调的细胞嗜性。

3.混合载体

通过将合成纳米颗粒与EV融合起来生产混合递送载体，具有两者的优点和缺点。因为它们更大，混合颗粒比 LNP/外泌体具有更大的承载能力，并且可能提供更好的靶向性，但代价是合成成分可能会导致与在 LNP中观察到的、类似的安全性和免疫原性挑战。