亲和层析是一种强大的分离技术，用于从复杂且具有挑战性的进料流中捕获目标产物，这使其成为病毒载体纯化的理想选择。亲和层析填料必须在温和的洗脱条件下表现良好，同时经得起严格的清洗和消毒程序。

然而，大多数病毒载体收获液含有低滴度的病毒载体和相对较高的杂质水平，这对亲和填料性能提出了很高的要求。病毒载体的敏感性及其在粒径大小和其它特征方面的可变性增加了与亲和层析工艺开发相关的挑战，包括选择正确的层析基质（填料/整体柱/膜/纤维）和配基。

敏感性、粒径、消毒和清洗方面的挑战

与重组蛋白、抗体在内的传统生物药物不同，病毒载体对高pH值和低pH值、高盐浓度和低盐浓度以及高剪切环境高度敏感。

亲和配基需要对目标病毒载体具有良好的结合行为，同时具有相对温和的洗脱条件，以避免在工艺过程中可能导致病毒颗粒感染性丧失的pH值变化。

不同类型的病毒载体具有不同的大小，从20-200nm不等，一些溶瘤病毒载体甚至更大，病毒粒径以反比关系影响亲和填料的动态结合载量 (DBC)。因此，对于更大的病毒载体，需要更大的柱-亲和层析系统，从而导致单元操作的总体成本增加。

一些病毒载体，特别是腺相关病毒 (AAV) 载体，通常以混合物的形式形成，其中一些包含完整的遗传物质，而另一些则不含或含有部分甚至不正确（例如宿主细胞）DNA。

一些病毒载体的大小和敏感性也会对去除生物负荷产生问题，尤其是病毒清除，因为通常不能使用 0.22 µM 过滤。因此，清洗和消毒用于亲和捕获的吸附基质的重要性增加了。这可能会有问题，因为一些用作亲和配基的蛋白质和肽与在线灭菌 (SIP) 方案不兼容。

有限的商业化产品

通常，病毒载体的亲和层析只有在商业上可行的配基可用时才能进行。直到最近，只有设计用于腺相关病毒 (AAV) 载体纯化的亲和层析填料的配基可用，用于纯化慢病毒 (LV) 载体的新型填料现已上市。

亲和层析填料商业化的一个挑战与相对于市售吸附基质孔径大小的病毒载体粒径有关。目前的产品通常是为抗体的最佳工艺而设计的，通常在10-15nm左右。许多病毒载体较大（约90-100nm的腺病毒、约80-100nm的γ-逆转录病毒和慢病毒），因此无法进入孔内的结合表面。因此，对这些较大的目标产物实施基于基球的方法可能会产生较低的产能。

另一个困难是亲和填料通常必须特定于给定的病毒载体（例如LV与AAV载体），并且在AAV的情况下，特定的血清型（AAV2、AAV8、AAV9 等）。LV载体是囊膜病毒，而AAV载体是无囊膜病毒。一般来说，无囊膜病毒比有囊膜病毒更稳定、更具抵抗力，这意味着从层析条件的角度来看，LV载体的洗脱条件和剪切应力比AAV更重要。

此外，虽然空衣壳/完整衣壳比例是AAV载体的一个问题，但对于像LV载体这样的囊膜病毒，产生大量非感染性慢病毒类似颗粒（例如外泌体）也会带来纯化困难。这意味着此类填料的应用不太灵活，病毒载体制造商很难使用单一亲和层析填料为一系列载体构建平台纯化工艺。

虽然市场上有AAV血清型特异性和非特异性亲和层析产品，但并非所有血清型都能很好地与亲和配基结合。因此，对于每种血清型，都应进行优化和筛选，以找到对特定血清型具有最佳亲和力的配基/填料。

几个重要的亲和填料属性

与任何其它亲和层析填料一样，与病毒载体一起使用的填料应该允许以高流速清除杂质，以减少纯化时间，从而降低成本，并且在这种情况下，还可以避免感染性的丧失，这些目标必须在温和的洗脱条件下实现。用于病毒载体的亲和填料还必须易于规模放大，并具有适合所选病毒载体的正确内置属性。

必须去除的主要杂质包括宿主细胞DNA和其它核酸。外来病毒和工艺相关病毒也必须清除，这要求辅助病毒（如AAV工艺中的腺病毒）不结合至所用的亲和配基。

考虑到病毒载体产品的滴度通常很低，在高上清液上样体积条件下将目标病毒与杂质进行稳健分离也很重要。亲和填料的设计还必须能够承受SIP和CIP过程，而不会影响其性能，因为它们在去除生物负荷方面起着至关重要的作用。

筛选是根本

高通量筛选是开发用于病毒载体亲和层析的新型配基和开发给定载体产品的最佳亲和层析纯化工艺的最佳方法。

基于噬菌体展示和基于文库的方法以及高通量工艺开发工具（例如液体处理和基于多孔板的筛选）允许筛选大量构建体和条件，以开发新型配基。Thermo Fisher Scientific使用病毒载体的特定属性作为采用质量源于设计方法的高通量开发的起点。在初始筛选阶段，这项技术确保正在开发的配基能够在特定条件下以所需的特异性洗脱。

同时，亲和层析工艺条件的优化应从小规模筛选开始，通常使用 96 孔板来检查不同的配基/基质和缓冲液系统。开发良好的缓冲液策略，使病毒载体产物与亲和填料良好结合，同时最大限度地减少病毒聚集，这一点至关重要。然后，通常在小规模设备 (1-5 mL) 上验证筛选，以确认筛选结果。

解决可放大性需要进一步地发展

对载体和血清型特异性亲和填料的需求为层析技术供应商提供了供应更多种类配基/基质解决方案的机会。为包括但不限于AAV在内的几种病毒载体选择现成的配基将为该行业带来良好的利益。这种基质可以基于从抗体到抗体片段再到合成肽的各种类型的配基，从而为实现任何给定病毒载体的更高纯度和选择性提供了选择。

随着更多利用病毒载体的基因和基因修饰细胞疗法实现商业化，对碱稳定性配基的需求只会增加，因为生产的批次数量呈指数级增长。应探索使用固定基球/填料以外的不同形式（例如，膜、整体柱）的亲和配基，以实现更快速地纯化不稳定的病毒载体产品。

由于体积流速低，目前使用亲和填料进行大型病毒载体纯化的工艺时间很长，这直接影响商品成本，工艺时间的任何减少都会导致成本降低并加快新疗法上市的速度。